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El fundador de Cali, Sebastián de Belalcázar, vino a América en el tercer viaje de Cristóbal Colón en 1498. En 1532, después de servir en el Darién y Nicaragua; se unió a Francisco Pizarro en la conquista del Perú. En 1534 Belalcázar funda la ciudad de Quito en una expedición enviada por Pizarro. Posteriormente, en búsqueda de El Dorado entra al actual territorio colombiano y funda las ciudades de Pasto y Popayán.
El 25 de julio de 1536 Belalcázar funda Santiago de Cali, inicialmente establecida al norte de la posición actual cerca de Vijes y Riofrío. Bajo órdenes de Belalcázar el capitán Miguel Muñoz reubicó la ciudad al lugar actual, donde el capellán Fray Santos de Añasco celebró una misa en el lugar hoy ocupado por la Iglesia de la Merced. Belalcázar designó como primera autoridad municipal a Pedro de Ayala.
Durante la colonia Santiago de Cali fue parte de la Gobernación de Popayán, la cual a su vez era parte de la Real Audiencia de Quito. Aunque Cali fue inicialmente la capital de la Gobernación, en 1540 Belalcázar asigna esta función a Popayándebido al clima templado de esa ciudad.
Hasta el siglo XVIII mucho del presente territorio de Cali estaba ocupado por haciendas. La ciudad era únicamente una pequeña villa en las proximidades del río Cali. En 1793Cali contaba con solo 6548 habitantes de los cuales 1106 eran esclavos. Las haciendas eran propiedad de la clase española, quienes tenían numerosos esclavos y dedicaban sus tierras a la ganadería y la siembra de la Caña de Azúcar. Muchas de estas haciendas darían origen a los actuales barrios, como Cañaveralejo, Chipichape, Pasoancho, Arroyohondo, Cañasgordas, Limonar y Meléndez.
En la época de la Colonia Cali ocupaba una posición estratégica para el comercio. Su ubicación nuevamente la haría sitio clave en el paso entre las regiones mineras deAntioquia, Chocó y Popayán. En esta época se construyó el primer camino de herradura entre Buenaventura y Cali.